索氏梭菌（Paeniclostridium sordellii）是一種可以引發(fā)急性感染的革蘭氏陽性細菌，環(huán)境分布廣泛。索氏梭菌感染不多見卻非常致命，可引發(fā)毒血癥，氣性壞疽，低血壓和休克等癥狀，尤其對于分娩或流產(chǎn)的女性風險極高，急性感染發(fā)生后的致死率近100%。索氏梭菌含致死毒素（TcsL）和出血毒素（TcsH）兩種外毒素，其中致死毒素被認為是造成其高致死率的主要毒力因子。
組合重復(fù)寡肽（Combined Repetitive Oligopeptides, CROPs）是一段位于TcsL羧基端的重復(fù)序列結(jié)構(gòu)。該結(jié)構(gòu)目前發(fā)現(xiàn)僅存在于包括TcsL在內(nèi)的大部分大梭菌毒素家族蛋白中，然而一直以來人們對其在毒素蛋白中的功能了解甚少。
北京時間2023年12月19日，陶亮團隊與合作者在Nature Communications上在線發(fā)表題為“Structural dynamics of CROPs control the stability and toxicity of Paeniclostridium sordellii lethal toxin”的研究論文（圖1），揭示了TcsL的組合重復(fù)寡肽區(qū)域具有調(diào)控毒素自剪切和毒性的功能，并從生化、細胞和結(jié)構(gòu)層面闡述了其工作機制；研究還進一步發(fā)現(xiàn)這種自調(diào)控機制在其它大梭菌毒素家族成員中也可能普遍存在。
文章鏈接：
https://www.nature.com/articles/s41467-023-44169-z
圖1. 論文截圖
為了探究組合重復(fù)寡肽結(jié)構(gòu)域的功能，研究團隊首先在枯草芽孢桿菌系統(tǒng)中表達了全長和組合重復(fù)寡肽缺失的TcsL蛋白。期間團隊成員發(fā)現(xiàn)了一個有趣的現(xiàn)象：組合重復(fù)寡肽缺失的TcsL在蛋白純化過程中會自發(fā)進行切割。通過質(zhì)譜分析和突變實驗證實切割位點位于543位的亮氨酸和544位的甘氨酸，這是TcsL中的半胱氨酸蛋白酶的自剪切位點。在全長蛋白中，需要較高濃度的六磷酸肌醇（InsP6）才能激活半胱氨酸蛋白酶的自切割活性，這說明缺失組合重復(fù)寡肽結(jié)構(gòu)會造成TcsL中的半胱氨酸蛋白酶活性失控變得過度活躍（圖2）。
圖2. 缺失組合重復(fù)寡肽區(qū)域會造成TcsL中半胱氨酸蛋白酶活性失控
為了進一步分析組合重復(fù)寡肽區(qū)域中抑制半胱氨酸蛋白酶活性的序列位點，研究者們構(gòu)建了一系列毒素的截短和突變體，通過InsP6誘導(dǎo)的體外酶切實驗，發(fā)現(xiàn)不同長度的組合重復(fù)寡肽片段對半胱氨酸蛋白酶的活性有著不同程度的影響。更有趣的是，缺失了組合重復(fù)寡肽的TcsL在細胞上的毒性甚至高于全長TcsL，說明該結(jié)構(gòu)區(qū)域還影響了毒素的細胞毒性（圖3）。
圖3. 不同長度的組合重復(fù)寡肽對TcsL自剪切和細胞毒性的影響
之后，陶亮團隊與施一公團隊開展合作，利用冷凍電鏡單顆粒三維重構(gòu)技術(shù)解析了在中性條件下和酸性條件下TcsL全長蛋白的三維結(jié)構(gòu)。研究者發(fā)現(xiàn)，在中性條件下，TcsL呈現(xiàn)一種開放式的構(gòu)象；而在酸性條件下，組合重復(fù)寡肽區(qū)域會發(fā)生近180°的旋轉(zhuǎn)，形成一種關(guān)閉式的構(gòu)象。其中關(guān)閉式的構(gòu)象中，組合重復(fù)寡肽區(qū)域與其它結(jié)構(gòu)域之間產(chǎn)生了兩個分子內(nèi)的互作界面，從而牢牢地“鎖住”了毒素的其它區(qū)域（圖4）。
圖4. TcsL存在開放和關(guān)閉這兩種不同的構(gòu)象，其中關(guān)閉式構(gòu)象會形成兩個分子內(nèi)作用界面
接下來，研究者們模擬了TcsL釋放到環(huán)境中，之后再接觸宿主的情形。利用小鼠攻毒模型結(jié)合病理分析，研究者發(fā)現(xiàn)缺少組合重復(fù)寡肽區(qū)域的TcsL在存在InsP6的環(huán)境中暴露僅僅20分鐘即會完全失活，這對于一種外毒素來說是不可接受的缺點。而全長的TcsL在類似環(huán)境下30分鐘也不會有任何活性損失（圖5）。最后，研究者們還將這一規(guī)律在大梭菌毒素家族的其他成員，包括TcdA，TcdB，TcsH和Tcnα中進行了驗證，發(fā)現(xiàn)它們的組合重復(fù)寡肽區(qū)域也有著類似的作用。
圖5. 缺少組合重復(fù)寡肽區(qū)域的TcsL很容易在接觸宿主前就發(fā)生失活
基于上述發(fā)現(xiàn)，研究者們提出了一種組合重復(fù)寡肽區(qū)域調(diào)控TcsL及其它大梭菌毒素穩(wěn)定性和毒性的模型（圖6）。作為一類外毒素，TcsL在被細菌釋放到胞外后將面臨各種復(fù)雜的環(huán)境條件。毒素可能以開放和關(guān)閉兩種構(gòu)象存在，其中開放式構(gòu)象的組合重復(fù)寡肽區(qū)域舒展，暴露出毒素的核心區(qū)，這種構(gòu)象對于攻擊宿主細胞更為有利。而在一些相對嚴厲的條件下（如低pH值等），毒素傾向于轉(zhuǎn)變?yōu)殛P(guān)閉式的構(gòu)象，這種構(gòu)象分子結(jié)構(gòu)更為緊密和牢固，不易發(fā)生自剪切和降解。這種構(gòu)象更利于維持毒素的穩(wěn)定性和活性，直至毒素分子接觸到其目標宿主細胞。
圖6. 研究者提出的組合重復(fù)寡肽自調(diào)控毒素分子穩(wěn)定性和毒性的模式圖
西湖大學(xué)微生物宿主交互實驗室（實驗室主頁：https://tao.lab.westlake.edu.cn/）致力于研究微生物-宿主之間的相互作用方式和內(nèi)在規(guī)律，尤其是從分子、生化、細胞、病理、遺傳等多角度研究重要病原細菌及其致病因子對宿主的影響及作用機制。西湖大學(xué)醫(yī)學(xué)院/生命科學(xué)學(xué)院研究員陶亮近年來以通訊作者在Cell、Cell Research、Nature Microbiology、Nature Communications、PLOS Pathogens等學(xué)科主流期刊上發(fā)表多篇學(xué)術(shù)論文。實驗室長期招收博士后、博士生和科研助理，方向包括且不限于微生物學(xué)、細胞生物學(xué)、化學(xué)生物學(xué)、分析組學(xué)、免疫學(xué)等，誠邀各方青年才俊加入、攜手共同成長！有意者請聯(lián)系陶亮博士（taoliang@westlake.edu.cn）。
來源 / 陶亮團隊
編輯 / 陳一鳴
校對 / 朱逸青
審核 / 李凱娜
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